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Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8131 (2023 ) Citer cet article Injection d'enrofloxacine pour porcs
Détails des métriques
L’administration massive de médicaments à base d’ivermectine aux humains ou au bétail est un outil potentiel de lutte antivectorielle pour l’élimination du paludisme.L'effet mortel de l'ivermectine contre les moustiques dans les essais cliniques dépasse celui prévu par les expériences de laboratoire in vitro, ce qui suggère que les métabolites de l'ivermectine ont un effet mortel contre les moustiques.Les trois principaux métabolites de l'ivermectine chez l'homme (c'est-à-dire M1 (3″-O-déméthyl ivermectine), M3 (4-hydroxyméthyl ivermectine) et M6 (3″-O-déméthyl, 4-hydroxyméthyl ivermectine) ont été obtenus par synthèse chimique ou modification/métabolisme bactérien. L'ivermectine et ses métabolites ont été mélangés dans le sang humain à diverses concentrations, nourris avec du sang à des moustiques Anopheles dirus et Anopheles minimus, et la mortalité a été observée quotidiennement pendant quatorze jours. Les concentrations d'ivermectine et de métabolites ont été quantifiées par chromatographie liquide liée au tandem. spectrométrie de masse pour confirmer les concentrations dans la matrice sanguine. Les résultats ont révélé que ni les valeurs CL50 ni CL90 ne différaient entre l'ivermectine et ses principaux métabolites pour An. dirus ou An. minimus. mortalité en comparant l'ivermectine et ses métabolites, démontrant un taux égal de destruction des moustiques entre les composés évalués. Ces résultats démontrent que les métabolites de l'ivermectine ont un effet mortel pour les moustiques égal à celui du composé d'origine, contribuant à la mortalité des anophèles après traitement des humains.
Sulaiman S. Ibrahim, Muhammad M. Mukhtar,… Charles S. Wondji
Douglas G. Paton, Lauren M. Childs,… Flaminia Catteruccia
Thomas Syme, Boris N'dombidjé,… Corine Ngufor
L'administration massive de médicaments à l'ivermectine (MDA) est un nouvel outil potentiel pour le contrôle et l'élimination du paludisme.L'alimentation en sang des humains ou du bétail traités à l'ivermectine est mortelle pour les moustiques anophèles présents en Afrique, dans les Amériques, en Asie, en Asie du Sud-Est et dans le Pacifique Sud1.Dans la sous-région du Grand Mékong (GMS), la lutte contre les vecteurs du paludisme est compliquée par les comportements alimentaires en plein air et en début de soirée2,3 ou en fin de matinée4 de nombreux vecteurs primaires et secondaires importants du paludisme dans la région.Plusieurs vecteurs du paludisme GMS sont sensibles à l'ivermectine à des concentrations pertinentes pour l'homme et le bétail, notamment Anopheles dirus ss5,6,7, Anopheles minimus ss5,6, Anopheles sawadwongporni, Anopheles campestris5 et Anopheles epiroticus7.
L’impact de l’ivermectine sur la survie des anophèles lorsqu’ils sont nourris avec du sang provenant d’un hôte traité in vivo dépasse systématiquement celui lorsque les moustiques sont nourris avec du sang enrichi d’ivermectine in vitro.Cette divergence a été observée lors d'essais cliniques avec Anopheles gambiae au Kenya8, et Anopheles dirus et Anopheles minimus en Thaïlande6.Une explication de cette différence est qu’il existe des métabolites actifs de l’ivermectine, qui possèdent un effet mortel sur les moustiques.Si les métabolites de l’ivermectine éliminés lentement produisaient un effet mortel sur les moustiques, cela entraînerait une durée de mortalité des moustiques plus longue que prévu5.
Il existe trois principaux métabolites produits chez l'homme à des concentrations détectables après l'ingestion d'ivermectine ;M1 (3″-O-déméthyl ivermectine), M3 (4-hydroxyméthyl ivermectine) et M6 (3″-O-déméthyl, 4-hydroxyméthyl ivermectine) (Fig. 1)9.Des travaux antérieurs de cristallographie de protéines dans un modèle de Caenorhabditis elegans avec le canal ionique chlorure glutamate-dépendant (GluCl), la cible invertébrée de l'ivermectine, ont suggéré que le premier anneau de sucre est essentiel à la liaison à la boucle M2-M3 et à l'activation ultérieure du GluCl. canal.De plus, il a été démontré que le quatrième carbone (C-4) de la structure du cycle macrocyclique se liait à la sous-unité M210.Ainsi, la déméthylation du deuxième cycle sucre (c'est-à-dire M1 et M6) ou l'hydroxylation du C-4 (c'est-à-dire M3 et M6) peuvent potentiellement affecter les conséquences mortelles des moustiques.
Structure moléculaire de l'ivermectine et de ses principaux métabolites humains.Structures moléculaires du composé parent (A) de l'ivermectine, (B) M1 (3″-O-déméthyl ivermectine) qui a un groupe méthyle retiré du deuxième cycle saccharidique, (C) M3 (4-hydroxyméthyl ivermectine) qui a un hydroxyle supplémentaire groupe en C-4, et (D) M6 (3″-O-déméthyle, 4-hydroxyméthylivermectine) qui a à la fois le groupe hydroxyle supplémentaire en C-4 et un groupe méthyle retiré du deuxième cycle saccharidique.Les cercles rouges indiquent des modifications dans les structures des métabolites par rapport au composé parent (B – D).
Ici, nous évaluons l’effet mortel des trois métabolites de l’ivermectine les plus abondants générés chez l’homme9 sur An.dirus, l'une des espèces les plus tolérantes à l'ivermectine, et An.minimus, l'une des espèces les plus sensibles à l'ivermectine1,5,6.
Les nourrissages préliminaires contre les moustiques ont produit des résultats de mortalité des moustiques incohérents (données non présentées).Pour étudier cela, des aliquotes de chaque repas de sang de moustique ont été analysées par chromatographie liquide associée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour vérifier les concentrations d'ivermectine et de ses métabolites.Une perte de deux à dix fois par rapport aux concentrations cibles prévues a été constatée lors de l'analyse des repas de sang par LC-MS/MS ;ivermectine 53 % de perte, M1 63 % de perte, M3 77 % de perte, M6 88 % de perte.Cette perte aléatoire résulte très probablement de la liaison non spécifique de l'ivermectine et de ses métabolites au plastique lors de la dilution dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour les préparations de repas de sang.Ainsi, les concentrations évaluées n'ont pu être appréciées à partir des quantités ajoutées et uniquement à partir de celles mesurées.Les résultats de survie des moustiques ont donc été liés aux concentrations d'ivermectine et de métabolites de repas de sang quantifiées par LC – MS / MS pour obtenir les estimations CL50 et CL90.Les résultats de survie des moustiques associés à des concentrations d'ivermectine ou de métabolites inférieures à la limite inférieure de quantification (LLOQ) ont été exclus des analyses CL50.La mortalité totale des moustiques a été évaluée 14 jours après l'alimentation comme principal paramètre pharmacodynamique.
Six répétitions avec un total de 4638 An.des moustiques dirus ont été utilisés pour calculer les valeurs CL50 et CL90 pour les composés de l'ivermectine, notamment : le composé parent (n = 1 142), M1 (n = 1 405), M3 (n = 1 203) et M6 (n = 1 428).Sept répétitions avec un total de 4789 An.minimus ont été utilisés pour calculer les valeurs CL50 et CL90 pour les composés de l'ivermectine, notamment : le composé parent (n = 1 284), M1 (n = 1 158), M3 (n = 1 318) et M6 (n = 1 626).Les trois métabolites de l’ivermectine avaient des effets mortels sur les moustiques, similaires à ceux du composé d’origine pour An.dirus (Fig. 2, Tableau 1) et An.minimus (Fig. 3, Tableau 1).La susceptibilité d’An.minimus était nettement inférieur à An.dirus de 5,3 à 6,9 fois selon le composé (tableau 1).De plus, la CL50 sur 10 jours de l'ivermectine pour An.dirus était de 9,68 [7,97–11,66] ng/mL et de 1,42 [1,22–1,59] ng/mL pour An.minimus, qui sont 3,6 fois et 3,8 fois plus élevées que celles précédemment rapportées dans les résultats des essais cliniques (2,66 [2,49-2,83] ng/mL pour An. dirus et 0,38 [0,37-0,42] ng/mL pour An. minimus), respectivement6.Cela confirme en outre que l’ivermectine et ses métabolites contribuent de manière égale à la mortalité in vivo des moustiques.Des écarts similaires ont été observés lors de la comparaison du délai de mortalité médiane des moustiques entre les données des essais cliniques et les données in vitro générées ici.La médiane An.la durée de survie des dirus était de 3 jours pour les données cliniques et de 10 jours pour les données in vitro à 5 ng/mL d'ivermectine.De même, la médiane An.la durée de survie minimale était de 3 jours pour les données cliniques et de 10 jours pour les données in vitro à 1 ng/mL d'ivermectine (Fig. S16).Cela a également été mis en évidence par un déplacement vers la droite de la courbe concentration-réponse lors de l'évaluation du délai médian jusqu'au décès avec une analyse dose-réponse, ce qui a abouti à une concentration estimée trois à quatre fois plus élevée associée à la moitié de la durée de survie maximale (TC50) pour les études in vitro. données comparées aux données cliniques (Fig. S16).De plus, l'ivermectine et ses métabolites ont montré un délai médian similaire à celui de la mortalité des moustiques dans les données in vitro générées ici (figures S17 et S18).Cela confirme en outre que l'ivermectine et ses métabolites contribuent de manière égale à la mortalité clinique globale des moustiques associée à l'administration d'ivermectine.
La mortalité d'Anopheles dirus résulte de l'administration d'ivermectine et de métabolites présents dans le sang humain.Les cercles ouverts représentent la mortalité cumulée des moustiques 14 jours après l’ingestion d’un repas de sang.Les lignes pleines représentent la relation concentration-réponse moyenne et la zone ombrée représente l'intervalle de confiance à 95 % associé à l'ajustement non linéaire.Les lignes noires pointillées représentent l’effet maximum fixe d’une mortalité de 100 % et l’effet minimum estimé associé à la mortalité de base observée chez les moustiques témoins.
La mortalité d'Anopheles minimus résulte de l'administration d'ivermectine et de métabolites présents dans le sang humain.Les cercles ouverts représentent la mortalité cumulée des moustiques 14 jours après l’ingestion d’un repas de sang.Les lignes pleines représentent la relation concentration-réponse moyenne et la zone ombrée représente l'intervalle de confiance à 95 % associé à l'ajustement non linéaire.Les lignes noires pointillées représentent l’effet maximum fixe d’une mortalité de 100 % et l’effet minimum estimé associé à la mortalité de base observée chez les moustiques témoins.
Les effets mortels de l'ivermectine administrée à des sujets humains dépassent ceux associés à l'exposition des moustiques anophèles aux mêmes concentrations d'ivermectine dans des échantillons de sang enrichis.Cette différence suggère que les métabolites de l’ivermectine pourraient contribuer substantiellement à son activité mortelle contre les moustiques.Cette étude confirme cette hypothèse.C’est la première fois que l’effet mortel des métabolites de l’ivermectine sur la survie des anophèles est étudié dans un système in vitro.Les trois principaux métabolites de l'ivermectine humaine (M1, M3 et M6) étudiés ici ont chacun un effet mortel sur les moustiques similaire à celui du composé parent de l'ivermectine pour An.dirus (Fig. 2, Tableau 1) et An.minimus (Fig. 3, Tableau 1), deux principaux vecteurs du paludisme dans le GMS.De plus, les CL50 sur 10 jours de l'ivermectine pour An.dirus et An.les minimus rapportés ici étaient respectivement 3,6 et 3,8 fois plus élevés que ceux rapportés dans un essai clinique précédent6.Cette divergence observée dans la mortalité des moustiques associée à l'ivermectine peut s'expliquer par les effets cumulatifs létaux de l'ivermectine et des métabolites (c'est-à-dire M1, M3 et M6) présents dans le sang humain après le traitement, alors que le sang enrichi en ivermectine ne contient que le composé parent.Il convient de noter que l'essai clinique précédent a administré l'ivermectine à la dose unique recommandée de 400 µg/kg6, qui est sûre et bien tolérée dans les MDA et avec des doses répétées5, et que les futures analyses pharmacocinétiques et pharmacodynamiques évalueront les concentrations de métabolites produits à cette dose. dose.
Cette conclusion diffère d'une étude précédente menée au Kenya qui avait étudié l'effet mortel des moustiques de l'ivermectine co-administrée avec la dihydroartémisinine-pipéraquine sur An.gambiae.L’essai a conclu que l’effet destructeur de moustiques de l’ivermectine pouvait être décrit sans prendre en compte de métabolites actifs inconnus8.Bien qu’il existe une relation concentration-réponse claire pour l’ivermectine et la destruction des moustiques, si les métabolites actifs ne sont pas pris en compte, les effets globaux létaux des moustiques sont sous-estimés d’un facteur de trois à quatre.La présente étude menée en Thaïlande démontre clairement que les principaux métabolites de l'ivermectine humaine ont des propriétés mortelles pour les moustiques qui confèrent des effets cliniquement pertinents.Il semble très probable que ces résultats soient généralisables, mais des études plus approfondies avec d'autres moustiques et vecteurs de maladies devraient être menées pour caractériser les activités des métabolites.
Les principaux métabolites trouvés dans les tissus du bétail (p. ex. bovins, porcs, moutons) sont l'hydroxylation en C-24 (24-hydroxyméthyl ivermectine) et la 3-O'-déméthylation (c'est-à-dire M1)11,12,13.Il est possible que différents métabolites de l'ivermectine circulent dans le sang du bétail après le traitement et cela devrait être évalué plus en détail.La voie sous-cutanée de l’ivermectine vétérinaire entraîne une élimination plus lente que l’administration orale chez l’homme, ce qui pourrait également modifier l’exposition de ces métabolites dans le sang au fil du temps.Il existe des différences pharmacocinétiques importantes entre les animaux, par exemple l'élimination de l'ivermectine chez les porcs est beaucoup plus rapide que chez les bovins, ce qui conduit à une biodisponibilité totale beaucoup plus faible même avec la dose standard plus élevée de 300 µg/kg chez les porcs par rapport à la dose de 200 µg/kg chez les animaux. bétail14.Une enquête complète sur l’effet pharmacocinétique et pharmacodynamique mortel des moustiques du bétail traité à l’ivermectine et sur la contribution potentielle des métabolites est justifiée.
La principale limite de cette étude est que la liaison non spécifique de l’ivermectine et de ses métabolites au plastique était un facteur de confusion.Il a déjà été démontré qu'une liaison non spécifique de l'ivermectine aux plastiques se produisait auparavant, avec des taux de récupération rapportés inférieurs à 30 %15, ce qui est similaire à nos évaluations de dilution de médicaments.Cela suggère que les différences de 20 à 35 fois dans l'effet mortel des moustiques provenant du sang enrichi en ivermectine par rapport au sang des sujets traités de notre publication précédente6 sont surestimées en raison de la liaison plastique non spécifique.La pertinence de ces résultats par rapport à ceux d'autres laboratoires dépend des différents plastiques et réactifs utilisés pour réaliser les dilutions.L'ivermectine se lie avidement au plasma avec une affinité de 93 %16, notre recommandation actuelle est donc de réaliser des dilutions d'ivermectine dans du plasma (ou des milieux contenant du plasma) et des flacons en verre.Pour ces raisons, nous avons utilisé les concentrations mesurées et non les concentrations ajoutées dans ces évaluations concentration-effet.
La modélisation mathématique joue un rôle de plus en plus important dans la planification des politiques de contrôle et d’élimination du paludisme.L'utilité dépend à la fois de la structure et de la généralisabilité des modèles ainsi que de la précision des paramètres d'entrée.Les exercices visant à prédire l’impact de l’ivermectine sur le paludisme doivent tenir compte de l’activité mortelle prolongée des moustiques résultant de ses métabolites.
Ces résultats in vitro démontrent que les trois principaux métabolites de l'ivermectine présents chez l'homme (M1, M3 et M6) ont un effet mortel sur les moustiques chez An.dirus et An.minimus, deux principaux vecteurs du paludisme dans le GMS.Les valeurs CL50 sur 10 jours de l'ivermectine associées au sang enrichi en ivermectine par rapport au sang collecté auprès de volontaires traités étaient 3,6 fois et 3,8 fois plus élevées (c'est-à-dire que la destruction des moustiques était inférieure) pour An.dirus et An.minimus, respectivement.Cette grande différence dans l’effet mortel des moustiques s’explique entièrement par la contribution des métabolites de l’ivermectine.Une modélisation pharmacocinétique et pharmacodynamique de population est nécessaire pour comprendre les profils concentration-temps de l'ivermectine et de ses métabolites, ainsi que leur relation avec la mortalité des moustiques, afin de prédire pleinement la durée et l'ampleur des effets cliniques mortels des moustiques de l'ivermectine.
Le composé parent d'ivermectine en poudre a été obtenu auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA).Le métabolite M3 (4-hydroxyméthylivermectine) a été synthétisé en modifiant synthétiquement le composé parent de l'ivermectine (WuXi AppTec (Tianjin) Co., Ltd, Tianjin, Chine).Le métabolite M1 (3″-O-déméthyl ivermectine) a été généré par l'exposition du composé parent de l'ivermectine à la biotransformation par une souche bactérienne exclusive (Hypha ID : Sp159) chez Hypha Discovery.Tout d’abord, un processus de criblage a été réalisé dans lequel le composé parent de l’ivermectine a été soumis à des biotransformations de cellules entières en utilisant différentes espèces et souches bactériennes connues pour produire des métabolites oxydés de composés exogènes.Les extraits de culture bactérienne ont été expédiés à MORU pour évaluation par LC-MS/MS afin d'identifier quelle souche produisait uniquement la structure cible M1.Le système LC-MS/MS utilisé était une chromatographie liquide ultra haute performance (pompe Quaternaire Agilent 1260, échantillonneur automatique Agilent 1260 haute performance et compartiment à colonne thermostaté Agilent 1290 SL, Agilent Technologies) couplée à un spectromètre de masse quadripolaire à temps de vol. (Q-TOF – MS) (TripleTOF 5600+, Sciex) avec une ionisation par électrospray utilisant une source d'ions DuoSpray9.Une fois la souche bactérienne idéale pour la production de M1 identifiée, la biotransformation bactérienne a été augmentée dans un lot de 2 L exposé à 200 mg d'ivermectine (soit 100 μg/mL) qui, après extraction et purification, a produit une quantité finale de 41,8 mg. du métabolite M1.Aucune souche bactérienne n'a été identifiée produisant du M6 (3″-O-déméthyl, 4-hydroxyméthyl ivermectine) en quantités suffisantes et traitables directement à partir de l'ivermectine.Par conséquent, un lot supplémentaire de M3 a été synthétisé et 200 mg ont été biotransformés en utilisant des lots de 2 × 1 L de la même souche bactérienne utilisée pour produire M1.Cela a abouti à 6,0 mg du métabolite M6 extrait et purifié.Les identités des produits métabolites M1, M3 et M6 ont été confirmées par spectroscopie par résonance magnétique proche (RMN).De plus amples informations sur ces processus et les aspects d'élucidation structurelle sont fournies dans les documents supplémentaires.
Le protocole d'étude a été approuvé par les comités d'éthique de la Faculté de médecine tropicale de l'Université Mahidol (MAL18006), du Comité d'éthique de la recherche tropicale de l'Université d'Oxford (OXTREC 33-18) et du Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR#2609).Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes des institutions énumérées ci-dessus.Chaque volontaire donneur de sang a reçu une explication de l'étude et a signé un consentement éclairé écrit avant d'entrer dans l'étude.
Du sang total a été prélevé sur des volontaires sains le jour de chaque alimentation par membrane de moustique.Le sang a été prélevé dans des tubes à héparine de sodium.Les composés ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à des concentrations de 2 mg/mL et des aliquotes de 12 μL ont été congelées à - 20 °C.Les composés ont été décongelés et des dilutions en série ont été réalisées dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 10 μL ajoutés à 990 μL de sang pour atteindre la concentration finale souhaitée pour les tests d'alimentation sur membrane de moustique.Les repas de sang témoins étaient constitués de DMSO préalablement congelé dilué dans du PBS pour correspondre au rapport le plus élevé de DMSO et de PBS administré aux moustiques dans les repas de sang contenant le composé.Une aliquote de 50 µL de chaque repas de sang de moustique a été congelée à -80 °C pour l'analyse LC-MS/MS.
Tous les moustiques ont été élevés au Département d’entomologie de l’Institut de recherche des sciences médicales des forces armées à Bangkok, en Thaïlande.Anopheles dirus ss et An.minimus ss ont été produits comme décrit précédemment17.Les moustiques adultes utilisés pour les expériences ont reçu une solution de 10 sucrose à volonté.Les moustiques ont été élevés à 25 ± 2 ° C et à 80 ± 10% d'humidité relative, ainsi qu'à une photopériode de 12 h de lumière et de 12 h d'obscurité.Les moustiques se trouvaient entre 5 et 7 jours après leur émergence au moment du repas de sang et étaient privés de sucre et avaient accès à l'eau 12 à 18 heures avant leur repas de sang.
Pour chaque alimentation en membrane de moustique, 1 ml de sang total mélangé aux différents composés dans une plage de concentrations a été proposé à des groupes de 40 An.dirus et 40 An.minimus via des mangeoires à membrane réchauffées à 37 °C.Après s'être nourris, jusqu'à 30 moustiques nourris avec du sang de chaque espèce ont été doucement transférés par aspiration dans des récipients en carton propres (0,5 L).Après le repas de sang, les moustiques ont été maintenus dans un incubateur à 25 ± 1 ° C et 80 ± 10% d'humidité, et ont reçu 10% de saccharose à volonté.La survie des moustiques a été surveillée quotidiennement pendant quatorze jours et tous les moustiques morts ont été éliminés par aspiration et enregistrés.Quatorze jours après le repas de sang, tous les moustiques restants ont été enregistrés comme vivants puis congelés.Les CL50 et CL90 des moustiques ont été estimées à l'aide d'une analyse concentration-réponse normalisée (IC50 et Hill), en supposant une mortalité maximale de 100 % des moustiques et une mortalité de base estimée des moustiques (c'est-à-dire la mortalité des moustiques à une concentration nulle de médicament).Le délai médian jusqu'à la mort a été calculé pour les moustiques soumis à 1 ± 0,5 ng/mL et 5 ± 0,5 ng/mL d'ivermectine, en utilisant à la fois des données cliniques et des données in vitro.Le délai médian jusqu'à la mort pour chaque concentration unique d'ivermectine a également été calculé et les données évaluées avec une analyse concentration-réponse normalisée (TC50 et Hill), en supposant un délai maximum jusqu'à la mortalité des moustiques de 10 jours et un taux de base estimé de mortalité des moustiques (c.-à-d. taux de mortalité des moustiques à concentration nulle de médicament).Une analyse similaire a été menée en comparant le délai médian jusqu'à la mort de l'ivermectine et de ses métabolites, en supposant un délai maximum jusqu'à la mortalité des moustiques de 14 jours et une pente fixe d'une valeur moyenne de -2,0 pour faciliter l'ajustement du modèle.Toutes les analyses de survie des moustiques ont été réalisées avec GraphPad Prism v.9.0 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA).
Les échantillons (100 µL) ont été aliquotés dans une plaque d'extraction de 1 ml à 96 puits, suivi de l'ajout d'une solution d'extraction à froid (450 µL d'acétonitrile à 90 % dans de l'eau contenant 15 ng/mL d'étalon interne d'ivermectine-d2) dans chaque puits à l'aide d'un pipette multi-distributeur.Le mélange a été mélangé sur un MixMate réglé à 1 000 tr/min pendant 10 min.La suspension a ensuite été centrifugée à 2 100 x g pendant 10 min à 4 °C pour séparer les précipités.Le surnageant clair (380 µL) a été transféré sur une plaque à 96 puits HybridSPE® Plus (P/N 575659-U, Supelco, Darmstadt, Allemagne) pour éliminer à la fois les protéines précipitées et les phospholipides.Du formiate d'ammonium 10 mM dans de l'eau contenant 0,1 % d'acide formique (100 µL) a été utilisé pour extraire les composés de l'échantillon dans la plaque réceptrice.L'extrait final a été mélangé à 1 000 tr/min pendant 5 min et centrifugé à 1 100 x g pendant 5 min à 4 °C avant l'analyse LC-MS/MS.
L'analyse LC – MS / MS a été réalisée à l'aide d'un système UHPLC Thermo Scientific (Germering, Allemagne) Dionex Ultimate 3000, couplé à un spectromètre de masse triple quadripôle 6500 + Sciex (Woodlands, Singapour).L'UHPLC Ultimate 3000 était équipé d'un Acquity HSS T3 (2,1 × 100 mm, 1,8 µm, Waters (Milford, MA)) avec une pré-colonne Vanguard de 5 mm (Waters) du même diamètre interne, de la même taille de particule et du même type.Le débit a été maintenu à 0,5 mL/min.La phase mobile contenait (A) 10 mM de formiate d'ammonium dans de l'eau ultrapure et (B) 5:95 (v/v) 10 mM de formiate d'ammonium dans de l'eau/acétonitrile, A et B avec 0,1 % d'acide formique.L'élution par gradient a commencé à 75 % de B, a augmenté jusqu'à 90 % de B en 3 min et est restée constante pendant 6 min.Le gradient est revenu à 75 % de B en 0,1 min avec 2 min de rééquilibrage jusqu'à l'injection suivante.Une vanne de dérivation a commuté le débit des déchets vers le MS/MS après 2,4 min jusqu'à 7 min.La durée totale d’exécution d’une injection à l’autre était d’environ 11 minutes.Le plateau de l'échantillonneur automatique était réglé à 4 °C, la température de la colonne était de 40 °C et le volume d'injection était de 5 µL.
L'ionisation par électrospray (ESI) fonctionnait en mode positif et la surveillance de réactions multiples (MRM) était utilisée en MS/MS.Trois transitions ont été surveillées pour chaque analyte ciblé9.Le temps de séjour a été fixé à 0,15 s pour donner plus de six points pour chaque pic ionique chromatographique.Le tableau S3 répertorie les conditions MS/MS pour chaque analyte par ordre de temps de rétention (tR).Le réglage du gaz du rideau était de 30 psi, les réglages des gaz sources 1 et 2 étaient respectivement de 40 psi et 55 psi, le réglage du gaz de collision moyen avec une tension de pulvérisation d'ions à + 5 000 V et le réglage de la température de la source du gaz était de 225 °C.Le logiciel Sciex Analyst 1.7.2 (Woodlands, Singapour) a été utilisé pour le traitement des données de contrôle des instruments.
La LLOQ a été déterminée pour chaque combinaison d'analytes sur la base des données d'exactitude et de précision après le prélèvement des échantillons tout au long du flux de travail, y compris l'extraction des échantillons et l'analyse LC-MS/MS.Les LLOQ étaient généralement de 0,25 ng/mL pour tous les analytes ciblés.
Toutes les déterminations des métabolites individuels de l'ivermectine, M1 et M3 ont été étalonnées à l'aide d'étalons d'étalonnage multipoints dans du sang total, qui ont encadré les échantillons de contrôle qualité (CQ).Des échantillons QC d'ivermectine, M1 et M3 à quatre niveaux de concentration ont été traités (en triple à chaque niveau) simultanément avec les échantillons de repas de sang de moustique et mesurés dans une seule série analytique, afin de garantir les performances globales de la méthode et la qualité du médicament rapporté. concentration.En raison de la limitation des quantités de matériel standard de référence M6 disponibles au moment de l’analyse, la courbe d’étalonnage et d’autres paramètres de contrôle de qualité internes du médicament parent ivermectine ont été utilisés pour évaluer les mesures de concentration de M6.
L’identification des analytes dans les extraits d’échantillons a été réalisée via tR et la présence de traces de surveillance MRM.
Les ensembles de données générés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.
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Nous remercions les volontaires pour leur don de sang, les infirmières de l'unité de thérapeutique clinique de l'hôpital universitaire des maladies tropicales Mahidol pour leur soutien, l'équipe de pharmacologie de MORU en particulier le Dr Urairat Koesukwiwat pour le développement de la méthode LC-MS/MS et la quantification. l'ivermectine et ses métabolites, l'AFRIMS Insectary pour produire les moustiques utilisés dans cette étude, et l'équipe de Hypha Discovery pour la génération des métabolites de l'ivermectine M1 et M6, pour lesquels les données spectroscopiques RMN ont été acquises par le Dr Chris Williams de l'Université de Bristol , ROYAUME-UNI.Cette étude a été financée par la Fondation Bill & Melinda Gates (INV-008941) et en partie financée par le Wellcome Trust (104926/Z/14/Z ; 220211).Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, ni dans la collecte, l’analyse et l’interprétation des données ou dans la rédaction du manuscrit.Aux fins du libre accès, les auteurs ont appliqué une licence de droit d'auteur public CC BY à toute version de manuscrit acceptée par l'auteur découlant de cette soumission.
Le matériel a été examiné par l’Institut de recherche militaire Walter Reed.Il n’y a aucune objection à sa présentation et/ou publication.Les opinions ou affirmations contenues dans le présent document sont les opinions privées de l'auteur et ne doivent pas être interprétées comme officielles ou comme reflétant les véritables opinions du ministère de l'Armée ou du ministère de la Défense.Les enquêteurs ont adhéré aux politiques de protection des sujets humains prescrites dans l'AR 70-25.
Département d'entomologie, Institut de recherche en sciences médicales des forces armées, 315/6 Rajvithi Road, Bangkok, 10400, Thaïlande
Kevin C. Kobylinski, Narenrit Wamaket, Sittinont Chainarin et Siriporn Phasomkusolsil
Mahidol Oxford Tropical Medicine Research Unit, Faculté de médecine tropicale, Université Mahidol, 420/6 Rajvithi Road, Ratchathewi, Bangkok, 10400, Thaïlande
Kevin C. Kobylinski, Phornpimon Tipthara, Rattawan Kullasakboonsri, Borimas Hanboonkunupakarn, Podjanee Jittamala, Nicholas J. White et Joel Tarning
Unité de recherche Mahidol Vivax, Faculté de médecine tropicale, Université Mahidol, 420/6 Rajvithi Road, Ratchathewi, Bangkok, 10400, Thaïlande
Narenrit Wamaket et Sittinont Chainarin
Département d'entomologie médicale, Faculté de médecine tropicale, Université Mahidol, 420/6 Rajvithi Road, Ratchathewi, Bangkok, 10400, Thaïlande
Département de médecine tropicale clinique, Faculté de médecine tropicale, Université Mahidol, 420/6 Rajvithi Road, Ratchathewi, Bangkok, 10400, Thaïlande
Département d'hygiène tropicale, Faculté de médecine tropicale, Université Mahidol, 420/6 Rajvithi Road, Ratchathewi, Bangkok, 10400, Thaïlande
Hypha Discovery Limited, 154B Brook Drive, Abingdon, OX14 4SD, Oxfordshire, Royaume-Uni
Renia Gemmell, John Boyle, Stephen Wrigley et Jonathan Steele
Centre de médecine tropicale et de santé mondiale, Département Nuffield de médecine clinique, Université d'Oxford, Old Road Campus, Oxford, OX3 7BN, Royaume-Uni
Nicholas J.White et Joel Tarning
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KCK, NJW, JT ont conçu l'étude ;KCK, NW, SC ont effectué des nourrissages sanguins de moustiques et une surveillance de la mortalité ;RK, PT ont effectué des dilutions et l'identification des métabolites de l'ivermectine ;PS et JT ont assuré la supervision administrative ;SP a fourni des moustiques ;PJ, BH ont effectué des prélèvements sanguins ;JS a supervisé l’équipe Hypha qui a recherché une approche pour produire et identifier les métabolites de l’ivermectine M1 et M6 ;JB, RG, SW production accrue et structures confirmées de métabolites ;KCK, PT, JT ont rédigé la première ébauche.Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
Correspondance avec Kevin C. Kobylinski.
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
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Kobylinski, KC, Tipthara, P., Wamaket, N. et al.Les métabolites de l'ivermectine réduisent la survie des anophèles.Sci Rep 13, 8131 (2023).https://doi.org/10.1038/s41598-023-34719-2
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DOOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34719-2
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Rapports scientifiques (Sci Rep) ISSN 2045-2322 (en ligne)
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